Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)
Метод двухэлектродной фиксации потенциала (1947 г.), с помощью которого Ходжкин и Хаксли сделали своё открытие даёт представление лишь об усреднённой активности многих тысяч ионных каналов на поверхности одного аксона. Вот если бы можно было использовать один электрод, настолько маленький, чтобы записать ток с одиночного ионного канала? Эта фантазия воплотилась в методе patch clamp (дословно – зажим напряжения) – методе локальной фиксации потенциала.
Рождению этого метода предшествовали опыты Альфреда Стрикхольма, выполненные в начале 1960-х. В них он использовал в качестве микроэлектродов стеклянные канюли с диаметром отверстия в несколько микрометров
Прижимая кончик такого стеклянного капилляра к мембране мышечного волокна, Стрикхольму удалось обеспечить электрическую изоляцию участка мембраны, попадавшего внутрь кончика пипетки.
В конце семидесятых годов XX века Эрвин Неер (E.Neher) и Берт Закман (B.Sakmann) предложили метод patch clamp – в основе которого использование супертонких стеклянных микроэлектродов, диаметр концевого отверстия которых составляет 1–2 мкм. В такую пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Если кончик такой пипетки совершенно гладкий и чистый, он плотно прилипает к мембране при контакте с клеткой, образуя изолированное для электрических токов соединение так называемый «гигаомный контакт». Часть мембраны, покрытая таким капилляром, называется patch и имеет площадь менее 10 мкм2. Значит велика вероятность, того что на нём может оказаться один единственный ионный канал. Подобная конфигурация называется cell-attached patch-clamp и позволяет записывать ионные токи, проходящие через конкретный канал, накрытый пипеткой.
Рисунок 49 Принципиальная схема patch clamp в конфигурации Cell-attached.
Примечательно, в методе patch clamp используются не две пары электродов, как при двухэлектродной записи потенциала (два внутриклеточных и два внеклеточных), а лишь одна пара. При этом электронная начинка усилителя с высокой скоростью чередует измерение потенциала клетки и введение в неё ионного тока. При этом один электрод работает сразу за два, что уменьшает повреждение клеток во время измерения. Любопытной особенностью patch clamp является то, что в единственной оставшейся паре электродов невозможно однозначно идентифицировать внеклеточный и внутриклеточный потенциалы. Металлический опорный электрод погружен в ванну, в которой находятся исследуемые клетки. А вот единственный стеклянный электрод, который контактирует с клеткой, может работать как внеклеточно (cell-attache и inside-out), так и внутриклеточно (whole-cell и outside-out) .
Микроскопические размеры электродов патч-зажима, и самих клеток вынуждают исследователей работать исключительно под микроскопом. Мало того, сам контакт микрокапилляра с мембраной клетки чрезвычайно чувствителен к вибрациям, поэтому микроскоп монтируется на антивибрационном столе, столешница которого плавает в потоке сжатого воздуха. А амплитуда токов, регистрируемых прибором, настолько мала, что электроды защищены от электрических наводок клеткой Фарадея.
Метод patch clamp открыл новую эру в электрофизиологии. А параллельное развитие молекулярной биологии привело к настоящему взрыву исследований ионных каналов в 1990-х годах.